羧酸酯酶（carboxylesterase，CarE）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法 50 管/48 樣

羧酸酯酶活性測(cè)定試劑盒

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

哺乳動(dòng)物CarE，也稱(chēng)脂族酯酶（aliesterase），廣泛分布于組織和器官，屬于絲an酸水解酶家族。CarE催化含酯鍵、酰胺鍵和硫酯鍵的內(nèi)源性與外源性物質(zhì)水解，但不能催化水解乙酰dan堿及其類(lèi)似物。CarE 參與脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝，并且與多種藥物、環(huán)境毒物以及致癌物的解毒和代謝有關(guān)，有機(jī)磷農(nóng)藥可結(jié)合并且抑制CarE 活性。

測(cè)定原理：

CarE 能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯，固藍(lán)顯色；在 450 nm 光吸收增加速率，計(jì)算CarE 活性。

組成：

試劑三：粉劑×2 支， 4℃保存，臨用前取 1 支試劑三，加 1.2ml 無(wú)水乙醇充分溶解；試劑四：粉劑×2 支，-20℃保存，臨用前取 1 支試劑四，加少量試劑二溶解；

工作液配制：臨用前配制，向 1 瓶試劑二中，加入溶解后的試劑三和試劑四各 1 支，充分溶解，過(guò)濾，4℃

避光保存，可用 1 周。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

1、細(xì)菌、細(xì)胞樣品制備

收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每 200 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 400μl 試劑一，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率 20％，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；12000g 4℃離心 30min，取上清液待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿；12000g 4℃離心 30min，取上清液待測(cè)。

3、液體：直接測(cè)定。

測(cè)定步驟：

分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 450 nm，蒸餾水調(diào)零。

試劑二置于 37℃水浴中預(yù)熱 30 min。

空白管：取 1ml 玻璃比色皿，依次加入 5μl 蒸餾水和 1000μl 試劑二，迅速混勻，于 450nm 處測(cè)定 3min

內(nèi)吸光值變化，第 10s 吸光值記為A1，第 190s 吸光值記為A2?！鰽 空白管=A2-A1

測(cè)定管：取 1ml 玻璃比色皿，依次加入 5μl 上清液和 1000μl 試劑二，迅速混勻，于 450nm 處測(cè)定 3min

內(nèi)吸光值變化，第 10s 吸光值記為A3，第 190s 吸光值記為A4?！鰽 測(cè)定管=A4-A3注意：空白管只需測(cè)定一次。

CarE 活性計(jì)算公式：

1、 組織中 CarE 活性

按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白在 37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加 1 定義為 1 個(gè)酶活單位。

CarE 酶活(U/mg prot)= (△A 測(cè)定管-△A 空白管) ×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T

= 67×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷Cpr

Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；V 樣：加入上清液體積，0.005 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，3min。V 反總：1.005ml；蛋白質(zhì)濃度需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

按照樣品質(zhì)量計(jì)算

單位的定義：每g 組織在 37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加 1 定義為 1 個(gè)酶活單位。

CarE 酶活(U/g 鮮重)= (△A 測(cè)定管-△A 空白管) ×V 反總×（V 樣總÷V 樣）÷W÷T

= 67×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷W

V 樣總：上清液總體積，1 ml；V 樣：加入上清液體積(ml)，0.005 ml；V 反總：1.005ml；W：樣品質(zhì)量（g）；

T：反應(yīng)時(shí)間（min）3min。

2、 細(xì)菌或細(xì)胞中 CarE 活性

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在 37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加 1 定義為 1 個(gè)酶活單位。

CarE 酶活(U/104 cell)= (△A 測(cè)定管-△A 空白管) ×V 反總×（V 樣總÷V 樣）÷細(xì)胞密度（104 cell/ml）÷T

= 67×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷細(xì)胞密度（104 cell/ml）

V 總：上清液總體積，1 ml；V 樣：加入上清液體積(ml)，0.005 ml；V 反總：1.005ml ；T：反應(yīng)時(shí)間（min），

3min。

3、 液體中 CarE 活性

單位的定義：每毫升樣品在 37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加 1 定義為 1 個(gè)酶活單位。

CarE 酶活(U/ml )= (△A 測(cè)定管-△A 空白管) ×V 反總÷V 樣÷T

= 67×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)

V 樣總：上清液總體積，1 ml；V 樣：加入上清液體積(ml)，0.005 ml；V 反總：1.005ml；T：反應(yīng)時(shí)間（min），

3min。

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