山li醇脫氫酶（sorbitol dehydrogenase，SH）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法100 管/96 樣

山li醇脫氫酶試劑盒 糖代謝

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

SH（EC 1.1.1.14）催化山li醇脫氫生成果糖，是調(diào)控生物體內(nèi)山li醇含量的關(guān)健酶之一。

測(cè)定原理：

SH 催化山li醇脫氫生成果糖，同時(shí)還原 NAD⁺生成NADH，測(cè)定 340nm 吸光度增加速率可以計(jì)算 SH活性。

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提取：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

在試劑二中加入 7.6ml 試劑一和 11.4ml 蒸餾水充分溶解，置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 5min；用不完的試劑 4℃保存一周；

在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本和 190μl 試劑二，混勻，立即記錄 340nm 處 20s 時(shí)的吸光值A1 和 2min20s 后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

SH 活性計(jì)算：

用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）SH 活力的計(jì)算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

SH（nmol/min/ml）= [ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=1608×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 SDH 活力的計(jì)算:

按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

SH（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

SH（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=1608×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

SH（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=3.216×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）SH 活力的計(jì)算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

SH（nmol/min /ml）= [ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=3216×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 SH 活力的計(jì)算:

按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

SH（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

SH（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=3216×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

SH（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=6.426×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

山li醇脫氫酶試劑盒 糖代謝